Structured illumination
Technik
Structured illumination war die erste hochauflösende Mikroskopiertechnik auf dem Markt. Die Auflösungserhöhung kann durch den sogenannten Moiré-Effekt beschrieben werden. Wenn zwei Gitter übereinandergelegt werden, kann man ein Muster erkennen, das eine niedrigere Frequenz hat als jedes der übereinanderliegenden Gitter (Moiré-Streifen). Wenn die Frequenzen eines Gitters und die nach der Überlagerung sichtbare Struktur bekannt sind, kann man die Frequenz des anderen Gitters zurückrechnen. In der Lichtmikroskopie wird eine 3D-Beleuchtungsstruktur mit bekannter Frequenz auf die Probe mit unbekannten Frequenzen überlagert. Aus den Frequenzen in den resultierenden Bildern kann man die Frequenzen in der Probe zurückrechnen. Mit dieser Technik kann man die Auflösung eines Lichtmikroskops um etwa den Faktor zwei erhöhen.
Nutzung
Ideal für Abbildungen von Volumen (z.B. ganze Zellkerne) mit hoher auflösung. Die Technik erzeugt hochauflösende 3D-Bilder, 2D messungen sind nicht möglich. Aus technischen Gründen müssen viele Bilder aufgenommen werden, um die vollständigen Objektinformationen tz rekonstruieren. Daher funktioniert diese Methode am besten bei fixierten Proben, die nach speziellen Protokollen gefärbt wurden. Es ist schwierig, quantitative Informationen aus den Bildern zu extrahieren, da diese das Ergebnis komplexer mathematischer Rekonstruktionen sind.
Konfiguration
Manufacturer:
General Electric
Type: OMX
Illumination:
Lasers: 405nm, 488nm, 593nm; Halogen (DIC)
Optics:
100x 1.4 oil immersion objective UPlanSApo (Olympus)
Cameras:
Photometrics Cascade II cameras, 512x512 pixel
max. field of view 40x40µm (512x512 pixel)
Image stacksize max. 40 x 40 x 15 µm, dz=0.125 µm
Filters:
442/46 (405)
525/50 (488)
615/24 (593)
629/53 (593)
685/40
Speed:
Time needed for acquisition approx. 2-5 minutes / stack, depending on the size of the stack (number of sections, colors, pixels)
Time needed for the reconstruction of super-resolution images from the already acquired stack: 1-10 minutes, depending on the size of the stack (number of sections, colors, pixels etc.). The reconstruction has to be done with the post-processing computer next to the OMX with SoftWorx software
Software:
Acquisition: DeltaVisionOMX Vers. 2.25.
Reconstruction: SoftWorx Vers. 5.1.0